آپتوژنتیک: کنترل کامل مغز

مقدمه و تاریخچه

آپتوژنتیک که حاصل ترکیب روش‌های نوری و ژنتیکی است یک تکنیک زیست شناسانه است که شامل استفاده از نور برای کنترل فعالیت‌های سلول‌ها، بویژه سلول های عصبی، در یک بافت زنده است. با استفاده از این روش می‌توان فعالیت‌های یک تک نورون یا تعدادی نورون به صورت همزمان را در یک بافت زنده (و حتی اگر موجود در حال حرکت هم باشد) کنترل و نظارت کرد و به طور دقیق میزان تاثیر تغییرات و دستکاری‌های صورت گرفته بر روی نورون را در لحظه (in real-time) اندازه‌گیری کرد. (Deisseroth et al, 2006).

در روش آپتوژنتیک کنترل سلول به کمک عملگرهای آپتوژنتیک (optogenetic actuators) انجام میشود و ثبت فعالیت های سلول نیز به کمک حسگرهای آپتوژنتیک (optogenetic sensors) انجام میشود.

اولین تلاش جدی در زمینه آپتوزنتیک به مقاله Gero Miesenböck و Boris Zemelman در سال ۲۰۰۲ برمیگردد. آنها در این کار تحقیقاتی توانستند ژن های پروتئین گیرنده نور نوعی مگس میوه را استخراج کرده و به کمک روش های مهندسی ژنتیک درون نورون های کشت شده هیپوتالاموس پستانداران منتقل و سپس بیان کنند و سپس در گام بعدی با استفاده از تکنیک های نوری این سلول ها را کنترل کنند. این روش بدلیل پیچیدگی بالا و نیازهای آزمایشگاهی زیادی که داشت چندان مورد توجه محققان دیگر قرار نگرفت.

قبل از این در سال ۱۹۷۱ Stoeckenius و Oesterhelt کانال هایی یونی حساس به نوری را در halobacteria کشف کرده بودند که به طول موج ۵۷۰ نانومتر (رنگ سبز) حساس بود. و نام آن را halorhodopsin گذاشتند که در واقع از دسته اُپسین‌ها بود. این پروتئین های حساس به نور هنگامی که با طول موج ۵۷۰ نانومتر مواجهه میشوند طی یکسری تغییرات ساختاری باز شده و اجازه عبور به آنیون ها را میدهند. حدود ۲۰ سال بعد نوع دیگری از این کانال های حساس به نور در جلبک Chlamydomonas reinhardtii کشف شد که به طول موج ۴۶۰ نانومتر (رنگ آبی) حساس بودند و channelrhodopsins نامگذاری شدند. این کانال ها هنگام مواجهه با طول موج ۴۶۰ نانومتر باز شده و اجازه عبور کاتیون ها را میدهند. چندی بعد نقشه ژنوم این جلبک توسط Georg Nagel،Peter Hegemann و همکاران تهیه شد و امکان استفاده از پروتئین های حساس به نور این جلبک را در جاهای دیگر میسر کرد.

در سال ۲۰۰۵ Boyden و همکارانش بصورت موفقیت آمیزی تواسنتند پروتئین channelrhodopsin-2 را در نورون های کشت شده هیپوکامپ، بیان کنند و به وسیله ی تکنیک های نوری این نورون ها را با دقت زمانی و مکانی بسیار بالایی کنترل کنند.

عملگرهای آپتوژنتیک چه هستند؟

عملگرهای آپتوژنتیک پروتئین‌هایی هستند که هنگام مواجهه با نور فعال میشوند و باعث تغییر فعالیت‌های سلول می‌شوند. مفیدترین و پراستفاده‌ترین عملگرها، اُپسین‌ها هستند که در طیف وسیعی از موجودات، از میکروارگانیزم‌ها تا نخستی‌ها یافت می‌شوند. اُپسین‌ها را میتوان به طور کلی در دو دسته عمده طبقه‌بندی کرد: اٌپسین‌های مربوط به موجودات میکروسکوپی (نوع ۱) و اَپسین‌های مربوط به مهره‌داران (نوع ۲)

نوع یک در موجودات میکروسکوپی یوکاریوت و پروکاریوت، مانند باکتری‌ها و جلبک‌ها یافت می‌شود، این اُپسین‌ها به کمک مهندسی ژنتیک به عنوان پمپ‌ها یا کانال‌های یونی در غشاء نورون قرار داده میشوند. (Oesterhelt and Stoeckenius, 1973; Nagel et al., 2002, 2003) این اُپسین‌ها در خود این جاندران کارکردهای گوناگونی مانند، راهیابی به طرف منابع انرژی، و دوری از محیط‌های پرخطر دارند. برای مثال در جلبک Chlamydomonas Reinhardtii که دارای اُپسین channelrhodopsin-2 است، این پروتئین های گیرنده نور در نقطه ای از بدن تجمع پیدا کرده اند و جلبک را به سمت جاهایی که نور خورشید وجود دارد هدایت میکنند تا از این طریق موجود فوتسنتر بهینه تری را انجام دهد.

نوع ۲ در سلول‌های جانوران مهره‌دار یافت می‌شود، که در این جانوران عمدتا در سیستم بینایی و همچنین به منظور تنظیم ریتم‌های شبانه روزی بدن، کاربرد دارد. نوع ۲ هنگامی که به منظور کنترل فعالیت‌های نورون‌ها به کار گرفته میشود نسبت به نوع یک دارای سرعت کمتری است.

نوع ۱ بخاطر ساده‌تر بودن دستکاری ژنتیکیش و سرعت بیشترش، در آپتوژنتیک بیشتر استفاد میشود.

تعدای از انواع متفاوت اُپسین‌ها که در غشا نورون قرار گرفته‌اند، و نسبت به نور حساس هستند، در اثر فعال شدن می‌توانند باعث تغییر رفتار نورون شوند.

عملگرهای آپتوژنتیک چگونه کار می‌کنند؟

هر دو نوع اُپسین برای فعال شدن نیازمند نوعی ویتامین A بنام رتینال هستند. هنگامی که رتینال با اُپسین ترکیب می‌شود، ترکیب رتینال-اُپسین را می‌سازد که به نور حساس است و هنگامی که جریانی از فوتون‌ها به این ترکیب برخورد کند باعث تغییر شکل (conformational change) این مولکول می‌شود. هنگامی که اُپسین در غشا نورون به کار گرفته شود این تغییر شکل می‌تواند باعث باز شدن کانالش یا فعال شدن پمپ یونیش شود و در نتیجه باعث فعال شدن یا غیر فعال شدن فعالیت نورونی شود. در نتیجه برای عملکرد درست عملگرهای آپتوژنتیک، وجود ویتامین A الزامی است. خوشبختانه ویتامین رتینال به مقدار زیادی در شبکه عصبی پستان‌داران یافت می‌شود و در نتیجه برای آزمایش بر روی پستان‌داران نیازمند وارد کردن آن به بدن آزمودنی‌ها نیستیم. در ادامه تعدادی از مهم‌ترین اقسام اُپسین‌ها را بر اساس تاثیرشان بر فعالیت نورونی را بررسی میکنیم.

اُپسینهای محرکِ فعالیت نورونی

Channelrhodopsins اولین اُپسین‌هایی بودند که به منظور استفاده در آپتوژنتیک به کار گرفته شدند. این پروتئین ها اولین بار در جلبک تک سلولی Chlamydomonas reinhardtii کشف شدند. (Nagel et al., 2002, 2003, 2005b) این جلبک دو نوع اُپسین را در بدن خود بیان می‌کند که نوع Channelrhodopsin-2 یا (ChR2) در آپتوژنتیک کاربرد دارد. (Boyden et al., 2005) ChR2 یک کانال یونی کاتیونی است که در اثر برخورد نور آبی (از ۴۵۰ تا ۴۹۵ نانومتر) ، باز میشود و اجازه ورود کاتیون ها به درون سلول را میدهد که باعث دیپولاریزیسیون نورون میشود. (Nagel et al., 2002, 2003, 2005b) در سال ۲۰۰۵ محققان اُپسین ChR2 را در نورون‌های کشت شده هیپوکامپ موش وارد کردند و به طور موفقیت آمیزی فعالیت نورون های آن را با دقت زمانی خوبی کنترل کردند. (Boyden et al., 2005) در این آزمایش محققان توانستند با پالس های میلی ثانیه ای از نور آبی، نورون هایی را که این اُپسین را بیان کرده بودند، به انجام فرایند پتانسیل عمل وادار کنند. در چنین شرایطی محققان توانستند نورون را به انجام پتانسیل عمل تا ۳۰ بار در ثانیه وادار کنند.

بعد از این موفقیت ابتدایی، تحقیقات در زمینه آپتوزنتیک بشدت وسعت پیدا کرد و انواع مختلفی از اُپسین ها با خواص متفاوت کشف شدند. (Yizhar et al., 2011a; Mattis et al., 2012) این خواص متفاوت به محققان اجازه میدهد که از این اُپسین ها برای کاربردهای متفاوتی در سیستم عصبی پستانداران استفاده کنند.

اُپسین‌های فوق سریع

با دستکاری ژنتیکی اُپسین‌هایی مانند ChR2 و کاهش زمان غیرفعال‌سازیشان، اُپسینی‌های فوق سریعی مانند ChETA و ChEF/ChIEF ساخته شدند. (Lin et al., 2009; Gunaydin et al., 2010; Mattis et al., 2012) این اُپسین‌ها در مواردی که نیاز به دقت زمانی فوق دقیق و شلیک بالای نورون برای کنترل فعالیت نورون نیاز است، استفاده می‌شوند. (برای مثال در کنترل نورونهایparvalbumin )

اُپسین‌های با عملکرد پله‌ای

ممکن است که در برخی از آزمایشات، محقق بخواهد نرخ شلیک خودبخودی جمعیتی از نورون ها را دستکاری کند. اُپسین های با عملکرد پله ای برای چنین حالتی بسیار مناسب هستند. که در واقع از دستکاری ژنتیکی ChR2 بوجود می آیند. در این حالت ChR2 به گونه ای تغییر داده میشود که مدت زمان باز بودن کانال آن افزایش یابد. مجموعه دستکاری های ژنتیکی که بر ChR2 انجام شد باعث بوجود آمدن ChR2(C128S/D156A) شد که زمان غیرفعالسازی خود بخودی اش حدود نیم ساعت بود. (یعنی بعد از تحریک تا نیم ساعت کانالش باز میمونه.) (Yizhar et al., 2011b)

اُپسین های مربوط به طیف رنگی دیگر

تلاش هایی برای تولید اُپسین های حساس به نور قرمز انجام شده است. و این به این خاطر است که نور قرمز دو مزیت عمده دارد. ۱٫ اینکه طیف نور قرمز کمترین تداخل را با طیف نور آبی دارد و ۲٫ اینکه نور قرمز توانایی نفوذ بیشتری در بافت عصبی دارد و این باعث میشود که روش های آپتوژنتیکی کمتر تداخلی شوند. اولین اُپسین حساس به نور قرمز بنام VChR1 است که از جلبک Volvox carteri استخراج شده است. (Zhang et al., 2008)

اُپسین های بازدارنده فعالیت نورونی

پمپ های کلرید: یکی از موثرترین و پر استفاده ترین اُپسین هایی که به منظور بازدارندگی فعالیت نورونی استفاده میشود NpHR است که از Natronomonas pharaonic بدست می آید. این اُپسین پس از فعال شدن با نور، یون های کلرید را بدرون سلول پمپ میکند که موجب Hyperpolarization نورون میشود.  (Han and Boyden, 2007; Zhang et al., 2007) (فرایند Depolarization تغییری در پتانسیل غشای نورون است که باعث فعالسازی و شلیک نورون میشود و Hyperpolarization تغییری است که باعث بازداری از شلیک نورون میشود.)

پمپ های پروتون (H+): پمپ های پروتون با پمپ کردن پروتون ها به سمت خارج است سلول، تاثیر بازدارندگی بر نورون دارند. اُپسین های Arch از Halorubrum sodomense، Mac از fungus Leptosphaeria maculans، ArchT و Halorubrum strain TP009 نمونه هایی از پمپ های پروتون هستند که عمل بخوبی باعث بازدارندگی نورون میشوند. (Chow et al., 2010; Gradinaru et al., 2010; Han et al., 2011)

اُپسین ها چگونه در نورون ها بیان میشوند؟

چندین روش برای این کار وجود دارد. یکی از روش هایی که بسیار پر طرفدار است استفاده از ناقل های ویروسی است، این روش به پژوهشگران این امکان را میدهد که با دقت بالایی مکان بیان اُپسین در مغز را مشخص کنند. در این روش ژنهای اُپسین مورد نظر را به کمک روش های مهندسی ژنتیک وارد ژنوم ویروس میکنند و سپس ویروس را به ناحیه مورد نظر از مغر تزریق میکنند. استفاده از این روش باعث بیان سریع و قدرتمند اُپسین ها در ناحیه مورد نظر میشود. ناقل های ویروسی متنوعی مانند لنتی ویروس ها، ویروس های وابسته به آدنو، رابیِس ویروس ها و ویروس هرپس سیمپلکس برای اهداف متفاوتی در موش، موش صحرایی، گورخر ماهی و پستانداران اولیه استفاده شده است. (Zhu et al., 2009; Zhang et al., 2010) البته مشکل این روش این است که ویروس ها توانایی حمل ژنهای دارای توالی طولانی تر از حد مشخصی را ندارند و این باعث بروز مشکلاتی میشود.

برای حل چنین مشکلی میتوان از حیوانات تراژن شده استفاده کرد. که کمبودهای روش قبل را ندارد. (Arenkiel et al., 2007; Zhao et al., 2008) ولی مشکل این روش زمانبر بودن و سخت تر بودن است.

تکنیک های نوری استفاده شده در آپتوژنتیک

لیزر: لیزر به دو جهت استفاده زیادی در آپتوژنتیک دارد اول اینکه اجازه استفاده از نور پهنای باریک را به پژوهشگران میدهد و دوم اینکه میتوان آن را بخوبی با فیبرهای نوری به کار برد. این ویژگی دوم بخصوص در مواقعی که مایل به تحریک عمیق مغز هستیم به کار می آید. لیزر حالت جامد با قدرت حداکثر ۱۰۰ میلی ولت انتخاب مناسبی برای کارهای آپتوژنتیک است. (Adamantidis et al., 2007; Aravanis et al., 2007)

پراکنش کم نور لیزر و قدرت بالایش لیزر را به گزینه خوبی برای دستکاری در بافت های زنده عصبی تبدیل کرده است. لیزر گزینه خوبی برای تحریک تک نورون ها یا الگوی خاصی از تعدادی نورون است. (Packer et al., 2013)

فیبرهای نوری امکان تحریک عمیق مغزی را به ما میدهند. قطر کوچک این فیبرها (۲۰۰ μm) میزان تخریب بافتی را به کمترین مقدار ممکن میرساند. و خوبی دیگر این فیبرها این است که بخوبی با لیزرها کار میکنند. (Warden et al., 2014)

دیود نورافشان یا همان ال ای دی: منبع ارزان قیمتی برای آزمایشات آپتوژنتیک است و همچنین توانایی تولید نورهای مختلف را نیز دارد. (Warden et al., 2014) مشکلات این روش قدرت کم این لامپ ها و تولید گرمای بالا است.

کاربرد

روش آپتوژنتیک دیدگاه ما به علوم اعصاب را تغییر داده است، و توانایی شناسایی مشکلات نورونی در بیماری های خاص را به ما داده است. این روش تابحال در مواردی مانند اختلالات خلقی (Covington et al., 2010; Tye et al., 2011, 2013; Lobo et al., 2012; Warden et al., 2012; Kim et al., 2013; Lammel et al., 2014; Sidor et al., 2015) اعتیاد (Lobo et al., 2010; Chen et al., 2013) پارکینسون (Gradinaru et al., 2009; Kravitz et al., 2010) اختلال وسواس فکری-عملی (Ahmari et al., 2013; Burguière et al., 2013) و تعدادی دیگر استفاده شده است.

آپتوژنتیک در مورد نقشه برداری از مدارهای عصبی آمیگدال که مربوط به موقعیت های ترس آور است، کاربرد داشته است. (Haubensak et al., 2010)

آپتوژنتیک همچنین در مطالعات پیاز بویایی نیز به کار گرفته شده است. (Smith et al., 2015)

رشد و توسعه آپتوژنتیک ادامه خواهد داشت و در سالهای آینده شاهد موفقیت های بیشتری از این روش خواهیم بود.

ضمیمه

پروتئین گیرنده نور (Photoreceptor protein): نوعی پروتئین حساس به نور است که مسئول سنجش و پاسخگویی به حضور نور در طیف وسیعی از موجودات است. پروتئین های گیرنده نور، در سلول‌های گیرنده نور، مسئول جذب فوتون ها هستند و سلسله تغییراتی را باعث میشوند که به پتانسیل عمل سلول های گیرنده نور می انجامد. به طور کلی سه نوع پروتئین گیرنده نور تابحال کشف شده اند: ۱٫ کریپتوکروم ها (cryptochromes) 2. اُپسین‌ها (opsins) و ۳٫ LITE-1. پروتئین‌های گیرنده نوری که در شبکیه چشم انسان و دیگر مهره‌داران وجود دارند از نوع اُپسین‌ها هستند و rhodopsin نامیده میشوند.

فوتون (Photon): یک ذره بنیادی است که به عنوان واحد کوانتومی تمام اشکال تابش الکترومغناطیسی از جمله نور مرئی شناخته شده است.

طیف مرئی: نام بخشی از طیف الکترمغناطیسی است که با چشم انسان قابل رویت و تشخیص است. طول موج طیف مرئی بین ۳۸۰ تا ۷۵۰ نانومتر و بسامد آن‌ها بین ۴۰۰ تا ۷۰۰ تراهرتز است.

+ منبع اصلی، این نوشته برای اولین بار توسط وبسایت ouroboros.ir ترجمه و منتشر شده است. هر گونه استفاده و بازنشر مطالب ذکر شده در این مقاله صرفا با ذکر منبع اصلی و ذکر منبع ترجمه، آزاد است.

اشتراک گذاری در:
صادق آدینه
صادق آدینه
کارشناس ارشد علوم شناختی و متخصص نورومارکتینگ هستم و علاقه‌مند به نوشتن درباره‌ی فلسفه، علم، روانشناسی، سینما و موسیقی.

دیدگاه‌ها

avatar
wpDiscuz